REALISATION D'UN FROTTIS BACTERIEN

 FROTTIS BACTERIEN

☰INTRODUCTION

La plupart des bactéries sont incolores, donc elles génèrent peu de contraste à l'observation microscopique. Par conséquent, pour observer les bactéries au microscope, il est nécessaire de faire la coloration. Une fois colorées, les bactéries peuvent être observées et étudiées par rapport à leur forme, leur taille et leur disposition.

Un frottis bactérien est une petite couche de bactéries placée sur une lame de verre et «fixées» par la chaleur ou autres, en partie pour s'assurer qu'elles restent attachées au verre, pour la coloration. Il peut être préparé à partir d'un milieu solide ou de bouillon

Ensuite, une coloration est appliquée. La surface et le cytoplasme des cellules bactériennes , l’ADN, l’ARN, les protéines et la chromatine sont chargés négativement (acide) pour les colorer un colorant chargé positivement (basique) est appliqué (Bleu de Méthylène, fuchsine basique, cristal violet, safranine, Vert de malachite....).

☰GENERALITE

Il y existe plusieurs points des importants à prendre en considération lors de la préparation d'un frottis pour la coloration :

• Les bactéries doivent être uniformément et légèrement dispersées.
• Les bactéries doivent être fermement fixées à la lame afin de ne pas être lavées pendant les procédures de coloration.
• Il est très facile de ne pas savoir de quel côté de la lame se trouve le frottis. Veillez à étiqueter le bord le plus éloigné de la diapositive.
• Laisser sécher votre lame à l'air avant que vous la fixez à la chaleur (les bactéries bouilliront et la morphologie cellulaire sera perdue)

☰ CONFECTION D'UN FROTTIS

❶ ÉTALEMENT DES FROTTIS

Dégraisser la surface de la lame en verre avec de l'alcool sur un bec Bunsen, la déposer sur un support de coloration avec la surface dégraissée vers le haut, laisser refroidir :

À partir des cultures

• A partir d'un milieu solide, placez une goutte d'eau dans une zone sur la lame. Pour un bouillon moyen, aucun liquide supplémentaire n'est nécessaire.
• A l'aide du boucle d'inoculation, mélangez complètement le spécimen (colonies bactériennes) avec l'eau et étalez le mélange sur environ la moitié de la surface totale de la lame.

À partir des écouvillons (prélèvement)

• Idéalement, si l'échantillon ne peut être prélevé que sur des écouvillons, deux écouvillons sont soumis. Les frottis ne doivent pas être préparés à partir d'un écouvillon après avoir été utilisé pour inoculer les milieux de culture.
• Les frottis des écouvillons sont préparés en faisant rouler l'écouvillon d'avant en arrière (L'écouvillon ne doit jamais être frotté, les éléments de frottis pourraient être brisés) sur les zones contiguës de la lame de verre pour déposer une fine couche de matériau échantillon . Cela préserve la morphologie et les relations des micro-organismes et des éléments cellulaires.

À partir de liquides épais ou semi-solides

• Les écouvillons peuvent également être utilisés comme outil pour la préparation de frottis à partir d'échantillons liquides épais ou semi-solides tels que les matières fécales.
• L'écouvillon est immergé dans l'échantillon pendant plusieurs secondes, puis utilisé pour préparer une fine couche de matériau sur la lame de verre pour la coloration et la visualisation. Cette méthode de préparation par écouvillon est adéquate mais peut produire des résultats moins souhaitables que d'autres méthodes.

❷ SECHAGE ET FIXATION DES FROTTIS

• Le séchage doit précéder la fixation. Doit se faire autant que possible à la température du laboratoire, a la rigueur en posant la lame sur une platine chauffante réglée à 37°, ou en la maintenant dans l'air chaud au-dessus de la veilleuse d'un bec Bunsen.

NB : Des précautions doivent être prises pour éviter une chaleur extrême car une déformation de la cellule et des éclaboussures peuvent se produire (altération de certains constituants, en particulier la paroi bactérienne).

• La «fixation» d'un échantillon fait référence au processus de fixation de cellules sur une lame. La fixation est souvent obtenue soit par chauffage (EX : en passant rapidement la lame trois fois à travers le bec Bunsen ), soit par traitement chimique de l'échantillon. En plus de fixer l'échantillon à la lame, la fixation tue également les micro-organismes dans l'échantillon, arrêtant leur mouvement et leur métabolisme tout en préservant l'intégrité de leurs composants cellulaires pour l'observation.