TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES

 EXAMEN MICROSCOPIQUE

Ⅰ. INTRODUCTION

L'analyse d'un prélèvement effectué dans un but diagnostique est en règle générale une analyse à la fois cytologique et bactériologique. Ainsi, l'examen microscopique est une étape clé dans la démarche diagnostique des infections bactériennes.

II. OBJECTIFS :

  1. Renseigne sur la présence de bactéries confirmant l'origine bactérienne d'une infection ,ce qui représente un élément majeur pour une prise en charge thérapeutique adaptée
  2. Oriente sur une famille de bactéries ou un genre bactérien, permettant d'adapter ou de modifier une antibiothérapie.
  3. En fonction du prélèvement ou du contexte clinique, il peut dans certains cas, en quelques minutes, identifier de façon quasi certaine un pathogène.

L'examen microscopique en bactériologie peut être effectué sans coloration de l'échantillon par observation directe entre lame et lamelle, ou bien après coloration

II. L’EXAMEN A L'ETAT FRAIS

Les méthodes fondées sur la technique de l'état frais correspondent à l'observation d'un matériel biologique ou d'une suspension bactérienne entre lame et lamelle sans fixation préalable.

☰ ETUDE QUALITATIVE

L’examen des micro-organismes à l’état frais est utile pour :

  1. Observer les activités cellulaires telles que la mobilité et la fission binaire.
  2. Observez les tailles et les formes naturelles des cellules,


☰ ETUDE QUANTITATIVE

Elle permet de répondre en nombre d'éléments figurés présents dans les prélèvements liquides par unité de volume (millimètre cube ou microlitre, millilitre).

On utilise dans ce but les hématimètres communément appelés cellules.

Ces lames de verre épaisses creusées de rigoles, présentent un quadrillage particulier sur la plate-forme centrale légèrement abaissée. Recouverte d’une lamelle posée sur les plateformes latérales élevées, un volume très précis et connu permet de dénombrer les cellules des liquides biologiques.

Comment choisir entre la cellule de Malassez, la cellule de Thoma et la cellule de Nageotte ?

  • - liquides à forte densité cellulaire (sang) : cellules (ou hématimètres) de Mallassez ou de Thoma.
  • - LCR et urine (faible densité cellulaire) : cellule de Nageotte.
  • - En fait ce choix n’a pas une importance réelle : il dépend surtout de l’habitude de l’opérateur.

A. Si le liquide à analyser est hémorragique

  1. Avant de compter les cellules autres qu’hématies il est préférable de lyser les hématies en diluant au 1/2 le liquide hémorragique à l’aide d’une solution à 0,5% d'acide acétique dans l’eau.
  2. Multiplier par 2 (facteur de dilution dû à la solution d’acide acétique) le résultat du comptage.

B. Si on prévoit un nombre élevé de cellules

  1. Diluer le liquide à analyser : à 1/2 ou 1/5 ou 1/10 ou plus, dans du sérum physiologique.
  2. Multiplier le résultat du comptage par la dilution.

C. Avant de charger la cellule :

  1. Placer une lamelle sur la cellule : pour la cellule de Malassez : lamelle plane,
  2. Poser la cellule sur une surface bien horizontale,
  3. "Coller" la lamelle sur la cellule, en humectant les deux bords de celui-ci avec un petit chiffon humide propre et essoré,
  4. Faire glisser la lamelle sur la largeur de la cellule et vérifier la bonne adhésion " cellule - lamelle".
1
2

D. Introduire le liquide à analyser dans la cellule :

  1. Bien homogénéiser le liquide à analyser (ou sa dilution),
  2. Entre cellule et lamelle, laisser rentrer, par capillarité, une goutte de l’échantillon à énumérer, grâce à une pipette Pasteur. La goutte ne doit pas déborder dans les rigoles de la cellule et la goutte doit recouvrir complètement et d’un seul coup toute la surface quadrillée de la cellule.
3

4

Attendre au moins 5 - 10 minutes, la cellule bien à l’horizontal, en chambre humide (par exemple une boite de Pétri avec un papier plié et humide au fond), avant de faire le comptage (les éléments cellulaires doivent sédimenter).
  • LA CELLULE DE MALASSEZ
Louis-charles Malassez est un scientifique français né en 1842-1909 à Nevers. Malassez est connu pour l'invention de l'hémocytomètre, un outil pour mesurer quantitativement le nombre de cellules sanguines.
  1. Le quadrillage total a un volume de 1 µl.
  2. Dimensions : L : 2,5 mm, l : 2 mm, H (ou profondeur) : 0,20 mm.
  3. Constitué de 100 rectangles d’égales surfaces.
  4. Dimensions : L : 2,5 mm, l : 2 mm, H (ou profondeur) : 0,20 mm.
  5. Constitué de 100 rectangles d’égales surfaces.
☰ AVANTAGE DE FAIRE LE COMPTAGE :
  1. Faire une observation à l’objectif x10 non seulement pour repérer le quadrillage mais aussi pour vérifier que les cellules à compter sont réparties de façon homogène ; si l’homogénéité est jugée insuffisante il faut tout recommencer, c’est-à-dire charger un nouvel hématimètre à partir de la suspension ré-homogénéisée
  2. Passer à l’objectif x40 pour effectuer le comptage
  3. Pour les éléments à cheval des lignes, comptez tous ceux sur les lignes à gauches et en haut. 
  4. Ne comptez aucun élément sur les lignes à droite et en bas.
  5. Le quadrillage est donc constitué de 10 bandes verticales de 0,25 mm de large et de 10 bandes 
  6. horizontales de 0,20 mm de large formant ainsi 100 rectangles, on ne comptera les cellules 
que dans 10 des 25 rectangles non contigus pris au hasard dans la cellule.
On fait ensuite la somme des cellules observées dans chaque rectangle, on divise ce
nombre par 10 (nombre de rectangles comptés), on obtient ainsi le nombre de cellules 
par rectangle, il suffit de multiplier le nombre obtenu par 100 pour connaître 
le nombre d'entités cellulaires par mm3
Astuce : la moyenne de 4 à 5 rectangle et on la multiplie par 100

☰ EXEMPLE DE COMPTAGE :

III. EXAMEN MICROSCOPIQUE APRES COLORATION
 La plupart des techniques utilisées au laboratoire de bactériologie médicale font appel à des colorations. La préparation est fixée sur une lame puis colorée.

☰ TYPES DE COLORATION MICROSCOPIQUE
Il existe trois grands types de coloration :
  1. Coloration de bleu de Méthylène (coloration simple)
  2. Coloration de Gram (coloration différentielle) 
  3. Coloration de coloration de Ziehl-Neelsen (coloration spéciale)
☰ METHODES DE D'OBSERVATION MICROSCOPIQUE
Il existe plusieurs méthodes d'observation microscopique dont entre autres :

1. Microscopie Optique à fond noir
Le microscope à fond noir permet d’obtenir à partir d'échantillons transparents, avec un faible contraste, des images bien résolues, contrastées, sans nécessiter une coloration préalable de l'objet. Même des échantillons vivants sont observables ainsi. Elle conduit à un arrière-plan sombre de l'image, sur lequel les structures à observer se détachent en clair.
Saccharomyces cerevisiae observé au microscope à fond clair
Saccharomyces cerevisiae observé au microscope à fond noir

2. Microscopie Optique à contraste de phase:
Transforme en niveaux de contraste les différences d'indices de réfraction entre deux structures, lesquelles se traduisent en différences de phase pour les ondes lumineuses les traversant. Visualise ainsi des structures transparentes quand leur indice de réfraction diffère de celui de leur voisinage. Permet d'observer des échantillons avec un contraste faible ou nul qui ne peuvent être observés avec un microscope à fond clair.
Ces microscopes sont équipés d'objectifs et d'un condenseur spécifiques pour le contraste de phase (deux dispositifs, appelés anneaux de phase, sont placés l'un dans le condensateur et l'autre dans l'objectif.
La lumière qui traverse l’échantillon subit un déphasage par rapport aux autres rayons lumineux. Les anneaux filtrent ces rayons déphasés et il en résulte une image avec un contraste accentué (l’existence d’un halo clair autour des détails sombres).
Photographie d'un cellule épithéliale vue par un Microscope à contraste de phase
Spirillum volutens en microscope à contraste de phase
3. Microscopie optique à fluorescence
La microscopie à fluorescence est une technique utilisant un microscope optique en tirant profit du phénomène de fluorescence. La fluorescence est la propriété que possèdent certains corps d'émettre de la lumière après avoir absorbé des photons de plus haute énergie.
Les mycobactéries apparaissent comme des bacilles fluorescents jaune sur fond rouge
4. Microscopie électronique
La limite de résolution du microscope optique est d’environ 0.2 µm. La structure interne détaillée des micro-organismes ne peut être étudiée que par microscope électronique. La résolution du ME est fortement augmentée parce que la longueur d’onde est environ 0.005 nm, 100.000 fois plus courte que celle de la lumière visible. Avec le microscope électronique, des points proches de moins de 5 ou 0.5 nm peuvent être distingués et le grossissement habituel est supérieur à 100.000x
Images obtenues par a/Microscope optique (160X) et b/ électronique (425X) de proteobacterium Spirillum volutans
La microcopie électronique est subdivisée en deux sous-méthodes : 
  1. Microcopie électronique à transmission (MET)
  1. Microcopie électronique à balayage (MEB)
☰ RESUME : 
Les renseignements collectés à l’examen macroscopique et surtout microscopique fournissent souvent 
des arguments diagnostiques de très fortes présomption qui vont permettre la mise en route 
d’une thérapeutique adaptée.

☰ REFERENCES :
  1. Microbiology laboratory theory & application, second edition, Michael J. Leboffe, Burton E. Pierce, 2012.
  2. Atlas de poche de microbiologie, Tony Hart, Paul Shears
  3. Prescott’s Microbiology, Joanne M. Willey, Linda M. Sherwood, Christopher J. Woolverton, tenth edition, 2017.
  4. Benson: Microbiological Applications Lab Manual, Eighth Edition.
  5. Microbiology PRINCIPLES AND EXPLORATIONS, Jacquelyn g. Black, Laura j. Black, 8th edition, 2012.
  6. Microbiologie, Prescott, Harley, Klein, 2ème édition française.
  7. Bactériologie médicale Techniques usuelles, François Denis, 3ème édition.





Commentaires

Enregistrer un commentaire

Posts les plus consultés de ce blog

Les Clue cells (cellules indices)

Image
 Les Clue cells (cellules indices)  Les Clue Cells sont des cellules épithéliales vaginales couvertes de Bactéries (coccobacile à Gram variables), signe évocateur gardernella, une espèce de bactérie communement rencontrée dans la flore vaginale mais peut devenir pathogène en cas de deséquilibre de celle-ci. Elles obtiennent leur aspect moucheté distinctif en étant recouvertes de bactéries.  Elles sont un signe médical de la vaginose bactérienne, en particulier celle causée par Gardnerella vaginalis , un groupe de bactéries à Gram variable. Cette infection bactérienne se caractérise par une odeur nauséabonde de poisson, de minces pertes vaginales et une augmentation du pH vaginal d'environ 4,5 à plus de 5,5. La détection des cellules indices est la procédure unique la plus utile pour le diagnostic de la vaginose bactérienne. _________________________________________________________ Moustapha DIABY Président du Forum de la microbiologie Président de Proximité Médicale Inter...
Lire la suite

REALISATION D'UN FROTTIS BACTERIEN

Image
 FROTTIS BACTERIEN ☰INTRODUCTION La plupart des bactéries sont incolores, donc elles génèrent peu de contraste à l'observation microscopique. Par conséquent, pour observer les bactéries au microscope, il est nécessaire de faire la coloration. Une fois colorées, les bactéries peuvent être observées et étudiées par rapport à  leur forme, leur taille et leur disposition . Un  frottis  bactérien est une petite couche de bactéries placée sur une lame de verre et «fixées» par la chaleur ou autres, en partie pour s'assurer qu'elles restent attachées au verre, pour la coloration. Il peut être préparé à partir d'un milieu solide ou de bouillon Ensuite,  une coloration est appliquée . La surface et le cytoplasme des cellules bactériennes , l’ADN, l’ARN, les protéines et la chromatine sont  chargés négativement (acide)  pour les colorer un colorant  chargé positivement (basique )  est appliqué ( Bleu de Méthylèn e, fuchsine basique , cristal violet , sa...
Lire la suite