COLORATION AU BLEU DE METHYLENE

☰ INTRODUCTION

Utilisé pour la première fois en 1886 dans le domaine médical par Dr Paul Ehrlich, le bleu de méthylène a été utilisé  pour la coloration des neurones vivants en bleu, et qui a le même effet sur le Plasmodium dans le sang humain.

Actuellement, il est largement utilisé dans les indicateurs chimiques, les colorants, les colorants biologiques et les médicaments

La coloration au bleu de méthylène est une coloration rapide, économique et d'usage courant.

☰ PROPRIETE

Le bleu de méthylène, ou chlorure de méthylthioninium est un composé organique, solide cristallisé inodore soluble dans l'eau et, dans une moindre mesure, dans l'éthanol. À l'état pur, il se présente sous la forme d'une poudre vert foncé, on le trouve commercialement également sous forme d'un sel double avec le chlorure de zinc, de couleur brune.

Le bleu de méthylène est un agent d'oxydoréduction (dépend de son état rédox : il est incolore à l'état réduit, mais est bleu à l'état oxydé).

☰ PREPARATION

• Dissoudre 0,3 à 0.5 g de chlorure de bleu de méthylène dans 100 ml d'eau distillée
• Mélanger jusqu'à dissolution complète des cristaux.
• Agiter délicatement le liquide et filtrer une petite partie du liquide avant chaque utilisation.
• L'idéal est de pouvoir laisser le bleu de méthylène s'oxyder pendant quelque semaines avant utilisation pour pouvoir obtenir une espèce de coloration "métachromatique" en bouchant le flacon avec un morceau de coton cardé et non avec le bouchon standard hermétique.

 ◈ Préparation du Bleu de méthylène selon Löffler : 

Bleu de méthylène : 0,30 g + Alcool éthylique 95% : 30,0 ml + Eau distillée 100,0 ml

☰PRINCIPE

Le principe obéit à la composition des parois cellulaires qui, généralement chargées négativement et les chromophores des colorants basiques, chargées positivement; ont tendance à adhérer aux parois cellulaires, ce qui en fait des taches positives.

La coloration au bleu de méthylène est une coloration simple où un seul colorant est utilisé pour mettre en évidence les structures particulières dans un spécimen (la forme, la taille et la disposition des bactéries). Les organismes d'un spécimen seront de la même couleur, même si le spécimen contient plusieurs types d'organisme.

⃞ Dans certains cas, la coloration au bleu de Méthylène donne de meilleurs résultats que la coloration de Gram. Parmi ces cas :

• Le bleu de méthylène (selon Löffler) a été traditionnellement utilisé pour colorer Corynebacterium diphtheriae pour l'observation des granules métachromatiques.
• Y. pestis, colorée au bleu de méthylène, elle présente une coloration intense à chaque extrémité du bacille, appelée coloration bipolaire, ce qui lui confère un aspect « épingle de sécurité ».
• Burkholderia pseudomallei : aspect bipolaire typique en « épingle de sécurité ».
• Dans le liquide céphalo-rachidien, permet de mieux contraster les bactéries à Gram négatif, Neisseria meningitidis et Haemophilus influenzae et le fond
• Haemophilus ducreyi colorées au bleu de méthylène, permettant d'observer l'aspect typique en « chaîne de vélo ».
• Respecte mieux la structure des cellules que le Gram.
• Il est également utilisé comme contre-colorant dans plusieurs autre colorations (méthode de Moeller, Macchiavello, Stamp, Ziehl-Neelsen ..)

 

 Y. pestis aspect« épingle de sécurité »

☰TECHNIQUE DE LA COLORATION AU BLEU DE METHYLENE

• Après un bon étalement du frottis bactérien et sa fixation
• Placer la lame sur un support de coloration et couler la solution de bleu de méthylène sur la lame. Laisser agir pendant environ 2 minutes
• Laver la lame délicatement avec de l'eau distillée, égoutter l'excès d'eau, éponger (ne pas frotter) avec du papier absorbant et laisser les lames sécher complètement à l'air.
• Examiner à l'objectif x100 à immersion (avec une goutte d'huile) avec un bon éclairage (diaphragme ouvert)

Couler une solution de bleu de méthylène sur un frottis

Après 2 min rincer à l’eau de robinet

Sécher entre deux feuilles de papier buvard puis observée à l'immersion

⃞ RECHERCHE DE LEUCOCYTES DANS LES SELLES DIARRHEIQUES

Déposer sur une lame microscopique une petite goutte de mucus fécal ou de selle liquide. Ajouter un égal volume de bleu de méthylène (bleu de Loeffler). Mélanger avec une petite baguette de bois.Recouvrir d'une lamelle. Laisser la coloration se faire pendant 2 à 3 minutes. Examiner à l'objectif à sec ( × 40 ou × 60).

☰INTERPRETATION

Les structures colorables apparaissent bleues, la coloration permet de détecter la morphologie de ces structures, leur mode de groupement et dans certains cas le type cellulaire

Coloration au bleu de méthylènes des levures 

Références:

1. Sigma-Aldrich- 50484 Methylene Blue Solution
2. protocols.io- Methylene Blue staining
3. Livre : Textbook of diagnostic microbiology 4th ED
4. Microbiology - OpenStax
5. Livre : Bactériologie médicale Techniques usuellese
6. Livre : Clinical Microbiology Procedures Handbook 4ed
7. Livre : Laboratory Manual and Workbook in Microbiology Applications to Patient Care 7th Edition
8. Dr. vikassaini : Yersinia, Pasteurella and Francisella
9. microbe-canvas : Methylene Blue staining
10. Himedia : Methylene Blue (Loeffler's)
11. Microbiología Ambiental : COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO DE LOEFFLER (coloración de gránulos metacromáticos):